抗精子抗体是指男性或女性对男性精液产生抵抗力,阻止精子与卵子正常结合,导致不育。抗精子抗体是一种复杂的病理产物,影响男性和女性,其确切原因尚未完全清楚。那么,抗精子抗体怎么检查啊?
1. 酶联免疫吸附测定
(1)精子抗原制备:筛选收集精液常规检查正常的精液,反复离心并用生理盐水洗涤,尽可能除去精浆,超声波粉碎,高速离心1015分钟,吸去上清液,测定上清液的蛋白浓度,将蛋白浓度稀释至3.5~5.0g/mL,形成精子抗原溶液。
(2)反应板包被抗原:将人精子抗原稀释至3.55g/mL,将包被液加入到聚氯乙烯微量测定板中,每孔100L,置于4冰箱过夜。
(3)封闭处理:第二天早上倒掉抗原液,用洗涤PBS洗涤3次,每次5分钟。每次洗涤后,将板在纸上拍干,然后加入200 L 1% 聚乙烯醇溶液。封闭,在室温下放置1 小时,然后按上述方法洗涤。
(4)加入待测样品:用PBS将样品稀释100倍,每孔加入100L,分别加入As-Ab血清和正常初生血清作为阳性对照和阴性对照,37孵育1小时,并按上述方法清洗。
(5) 添加酶结合物:HRP-Protein A 按1:640 稀释,每孔加入100 L,室温放置1 小时,洗涤同上。
(6)酶反应:每孔加入新鲜配制的OPD底物溶液50 L,室温避光10 min,每孔加入10% H2SO4终止液50 L。
(7)结果判断:用490m酶标仪测定OD值。 OD值2.0视为阳性。
2. 生物素-亲和素酶联免疫吸附测定
(1) 将26g/mL人精子膜抗原包被液加入40孔微量测定板中,每孔100L,4孵育过夜。加入1%聚乙烯醇,37封板30分钟,用洗涤液洗涤3次。
(2)将待测血清1:1000(宫颈粘液1:100)稀释至每孔100L,37孵育60分钟,洗涤同上。
(3) 1:100生物素化羊抗人IgG、IgA或IgM,每孔100 L,37,60 min,洗涤同上。
(4) 1:100酶标亲和素,每孔100 L,22孵育30 min,洗涤同上。
(5) 每孔加入100 L底物,37孵育510分钟,加入50 L 8 mol/L H2SO终止反应。
(6)用酶标检测仪测定A490光密度(OD)值,即待测双孔平均值与阴性双孔平均值之差。血清OD 值为0.20(宫颈粘液OD 值为0.10)用作AsAb 阳性的标准。